Efavirenz + emtricitabine + ténofovir 57

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Combinaison de ténofovir et emtricitabine et efavirenz: In Vitro Modulation de ABC Transporter et intracellulaires Drug Accumulation ▿ Laurence Bousquet 1. 2. Alain Pruvost 1. Anne-Cécile Guyot 1. Robert Farinotti 2. 3 et Aloïse Mabondzo 1. * 1 CEA, iBiTecS, Service de Pharmacologie et d'Immunoanalyse, Laboratoire d'Etudes du Métabolisme des Médicaments, Equipe Médicaments et Neuropharmacologie, Yvette F-91191 Gif, France 2 Pharmacie Clinique, EA 2706 Barrières ET Passage des Médicaments, Université Paris Sud, Faculté de Pharmacie, Châtenay-Malabry 92296, France 3 Pharmacie, Hôpital Pitié-Salpêtrière, Assistance Publique des Hôpitaux de Paris, Paris, France ABSTRAIT protéines efflux ont été montré pour affecter grandement l'absorption de médicaments antirétroviraux par les cellules et entraver leur accès au site de réplication immunodéficience humaine de type 1 du virus. Cette étude a évalué les facteurs qui peuvent conduire à des interactions médicamenteuses entre l'emtricitabine (FTC), le ténofovir (TFV) et efavirenz (EFV), y compris la modulation de l'expression et de la fonction transporteur d'efflux. cellules périphériques mononucléaires du sang de volontaires en bonne santé ont été utilisés pour déterminer si oui ou non une interaction entre les médicaments antirétroviraux et les cellules cibles a eu lieu dans une combinaison quelconque de FTC, TFV, EFV, FTC-TFV, TFV-EFV, ou FTC-TFV-EFV. Après 20 h de traitement, les concentrations de médicament intracellulaires ont été mesurées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse. fonctionnalité du transporteur d'efflux et les propriétés des médicaments inhibiteurs ont été évalués par la mesure de fluorescence efflux de colorant. ABCB1 (P-glycoprotein), SCBA 1 à 6 (protéine associée à la résistance multidrogue) et l'OAT (anion organique transporteur) expression en réponse aux traitements a été quantifié par PCR semi-quantitative en temps réel. Les cellules traitées avec une combinaison double (FTC-TFV ou TFV-EFV) ou la triple combinaison (FTC-TFV-EFV) produits plus élevés de la FTC et TFV concentrations intracellulaires que les cellules traitées avec FTC ou TFV seul. Toutefois, aucun changement de la concentration intracellulaire EFV a été observée. FTC a eu tendance à induire l'expression de l'ARNm abcc5 et EFV ont tendance à induire ABCC1 et ABCC6 expression de l'ARNm, alors que TFV tendait à réduire MDR1. ABCC1. abcc5. et l'expression de l'ARNm ABCC6. Dans ces conditions, une diminution de la fonctionnalité du SCBA a été observée et cette diminution est associée aux actions inhibitrices directes de ces médicaments. Cette étude in vitro révèle un avantage de la combinaison FTC-TFV-EFV en fonction des concentrations de FTC et TFV intracellulaires et met en évidence les mécanismes pharmacologiques qui conduisent à cet effet. L'administration combinée d'au moins trois virus de l'immunodéficience anti-humaine (anti-VIH) médicaments de différentes classes de médicaments comme traitement antirétroviral hautement actif a été montré pour ralentir la progression de la maladie, d'améliorer la survie, et se traduire par une meilleure virologique et les réponses immunologiques (10 ). Le Groupe spécial États-Unis de l'International AIDS Society recommande des thérapies combinées qui comprennent un inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse (INNTI) ou un inhibiteur de protéase potentialisé par le ritonavir à faible dose, chaque combiné avec deux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INTI) ou nucléotidiques de la transcriptase inverse (INtTI ), pour le traitement de l'infection par le VIH chez l'adulte (18). Atripla (Bristol-Myers Squibb et Gilead Sciences), qui contient le INNTI efavirenz (EFV), l'emtricitabine INTI (FTC) et le INtTI fumarate de ténofovir disoproxil (une prodrogue orale du ténofovir [TFV]), est la première fois par jour seul comprimé régime (29). La résistance virale, un manque d'adhésion au régime de traitement, et les facteurs pharmacologiques peuvent contribuer à l'échec du traitement anti-VIH. Les efforts visant à prédire l'échec du traitement se concentrent actuellement sur la mesure des concentrations de médicaments antirétroviraux plasmatiques (38). Cependant, ce ne sont pas la seule variable biologique concerné. systèmes d'efflux des médicaments de transport, telles que la P-glycoprotéine (Pgp) et des protéines associées à la résistance multirésistantes (MRP, ou ABCCs), qui se traduisent par de faibles niveaux intracellulaires de médicaments antirétroviraux parentales ou de leurs dérivés actifs, revêtent une importance particulière (26). L'efficacité d'une thérapie de combinaison dépend du niveau d'activation des cellules cibles et sur des interactions médicamenteuses qui peuvent limiter l'accès aux médicaments aux sites cibles de la réplication du VIH. ABCCs Pgp et appartiennent à la superfamille ATP-binding cassette (ABC), des protéines de transport membranaire (20. 30). Ils sont présents dans les lymphocytes et les monocytes (1. 32) et sur les barrières physiologiques (par exemple, la barrière hémato-encéphalique [36]), où ils sont impliqués dans l'efflux actif d'une grande variété de médicaments (17). substrats de transport de Pgp sont principalement hydrophobes. SCBA substrats sont représentés par des anions amphiphiles, comme les conjugués de composés lipophiles avec le glutathion, le glucuronate ou le sulfate (31). Les interactions des inhibiteurs de la protéase avec la Pgp et ABCCs ont été largement étudiées, et on a montré qu'ils sont des substrats ou des modulateurs des transporteurs d'efflux (15. 23. 33. 9. 42. 48. 54). Toutefois, les données concernant l'interaction des INNTI ou INTI avec les transporteurs d'efflux sont rares et contradictoires (7. 9. 13. 46. 49. 50. 57). Certaines études indiquent que les INNTI ne sont ni des substrats Pgp (13. 50), ni des modulateurs Pgp (7). D'autres indiquent la possibilité d'un traitement à long terme avec l'EFV pour induire l'expression de Pgp dans des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) (9) ou dans la lignée de cellules LS180 (57). EFV, mais pas TFV et la FTC, semble inhiber la Pgp dans MDCKII cellules MDR1 (46. 49). Une publication récente décrivant une étude réalisée avec la lignée cellulaire de LS180 a montré que l'incubation à long terme avec des concentrations élevées de FTC, mais pas TFV, peut augmenter l'expression de l'ARNm MDR1 et la fonction Pgp (57). L'interaction de ces médicaments avec ABCCs a été rapportée. Le rôle de ABCC4 dans l'élimination rénale du FPV a été démontrée chez la souris knock-out ABCC4 (24). Dans ABCC2- et les cellules MDCKII ABCC4 surexprimant, Ray et al. (46) a montré que ABCC4, mais pas ABCC2, transporte TFV. Ils ont également rapporté que FPV n'a pas d'interaction avec l'accumulation de calcéine induite par ABCC2. Cependant, dans une étude portant sur la même lignée cellulaire, Weiss et al. (56) ont démontré que TFV, EFV et FTC interagissent avec ABCC1, ABCC2 et ABCC3. L'interaction de TFV avec les transporteurs humains organiques d'anions (OAT) hOAT1 et hOAT3, deux membres du transporteur soluté (SLC) famille, a également été rapporté dans une étude avec la lignée cellulaire HEK293 transfectées (52). In vivo, des combinaisons de FPV et de la lamivudine ou de la FTC semblent offrir de meilleures réponses virologiques (3). Un régime de ténofovir disoproxil fumarate-FTC et EFV démontre une durabilité supérieure de la suppression de la charge virale et une amélioration de la sécurité et le profil morphologique par rapport à ceux obtenus avec la zidovudine-lamivudine et EFV (2. 43). combinaisons de médicaments sont destinés à la réalisation de la synergie entre les composés et de réduire la probabilité du développement de la résistance aux médicaments. La présente étude a évalué si et comment les combinaisons doubles ou triples de FTC, TFV et EFV peut conduire à des concentrations plus élevées de médicaments intracellulaires. Une attention particulière a été accordée à la modulation de l'expression du transporteur et de la fonction ou de l'inhibition du transporteur directe par des agents antirétroviraux. MATÉRIAUX ET MÉTHODES Les sujets et le traitement cellulaire. PBMC de donneurs sains (Etablissement Français du Sang, Rungis, France) ont été isolés et traités avec le contrôle du véhicule (0,2% de diméthylsulfoxyde [DMSO]; Sigma Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France) ou avec la FTC (un don généreux de Gilead Sciences), TFV (un don généreux de Gilead Sciences), EFV (un don généreux de Bristol-Myers Squibb), seul ou en combinaison (5 pM de chacun), en milieu RPMI 1640 (Gibco, Cergy Pontoise, France) complété avec 10 % de sérum bovin fœtal, 2 mmol / l de glutamine, 50 pg / ml de pénicilline, 50 pg / ml de streptomycine et 100 ug / ml de néomycine (Gibco) pendant 20 h à 37 ° C dans une atmosphère humide avec 5% de CO 2. Quantification de la FTC, TFV et EFV dans les CMSP par chromatographie liquide-spectrométrie de masse. Après 20 heures d'incubation avec les médicaments, les analytes ont été extraites des PBMC, des échantillons, des contrôles de qualité et des normes, comme indiqué précédemment (44). Une fraction de 40 ul de la solution restante a été injectée dans un liquide à haute pression chromatographe en tandem spectromètre de masse, comme décrit précédemment (35), qui a été adapté pour la détection de la FTC et EFV. (Taille de particules, 4 um, 50 de 2 mm, Phenomenex, Le Pecq, France) En bref, la séparation chromatographique a été réalisée sur une colonne Synergi Polar-RP thermostatée à 40 ° C, avec une phase mobile consistant en l'acide formique à 0,5% et gradient de méthanol délivré à un débit de 0,3 ml / min, entre 2 et 80%. La détection par spectrométrie de masse a été effectuée avec un triple quadripole de masse en tandem spectromètre (Quantum Discovery) avec une source d'ionisation par électropulvérisation (Thermo Fisher Scientific) dans le mode d'ionisation positif pour FPV et FTC et dans le mode d'ionisation négative pour EFV. Les PBMC dans chaque échantillon (n = 12) ont été comptées en utilisant un test biochimique validé, comme décrit précédemment (6). Pgp ou de la fonction ABCC. Afin d'expliquer les différences de drogue quantification, les fonctionnalités de Pgp et ABCC ont été évalués par la mesure de l'efflux colorant fluorescent (0,1 pmol / litre calcéine-acetoxymethylester) en présence ou en l'absence d'inhibiteurs spécifiques (2 uM cyclosporine [Sigma Aldrich] et 30 uM MK571 [Calbiochem, VWR, Fontenay-sous-Bois, France]) pendant 30 min à 37 ° C. Ciclosporine à une concentration de 2 uM est un inhibiteur spécifique de la P-gp (34), et MK571 est un inhibiteur spécifique de la résistance aux médicaments SCBA associée (à savoir ABCCs 1, 2 et 3) (16). Les cellules ont ensuite été lavées deux fois dans une solution saline tamponnée au phosphate froid, fixées avec CellFix fixatif (01:10, 400 ul, 4 ° C) et analysé par cytométrie en flux. La fluorescence due à la calcéine a été tracée sous forme d'histogramme de coloration fluorescente dans le canal 1 (FL1). la fonction de transporteur a été quantifiée comme décrit précédemment (45) à l'aide de l'équation suivante: Activité (pour cent) = [100 - (G signifie calcéine / G signifie inhibiteur)] x 100, où G signifie calcéine est la fluorescence moyenne géométrique de la calcéine dans le les échantillons testés et G signifient inhibiteur est la fluorescence moyenne géométrique de la calcéine en présence d'inhibiteur. Chaque expérience a été réalisée avec des PBMC provenant de sept donneurs différents. expression de l'ARNm de Transporter. Afin d'expliquer l'effet du traitement antirétroviral sur les fonctionnalités de ABCC, nous avons réalisé d'autres expériences sur l'ARNm transporteur expression. Après le traitement antirétroviral 20 h, l'écoulement et l'arrivée de l'expression du transporteur ont été déterminés par PCR en temps réel (n = 3). L'ARN a été isolé avec un mammifère kit d'ARN total GenElute (Sigma Aldrich). La concentration d'ARN total et la pureté de l'ARN ont ensuite été déterminées en mesurant l'absorbance à 260 nm et 280 nm. A 260 / A 280 rapport variait de 1,8 à 2. Un échantillon de 0,5 pg d'ARN total a été converti en ADNc avec des amorces aléatoires dans un volume total de 10 ul en utilisant un kit de premier brin RT 2 (Superarray Bioscience Corporation, Frederick , MD). L'ADNc a été dilué avec de l'eau distillée jusqu'à un volume de 100 ul. Chaque amorce dans le jeu d'amorce a été utilisé à une concentration de 0,4 uM pour le RT 2 profils matrice PCR spécifique, selon le protocole du fabricant. Les plaques utilisées pour l'analyse étaient ABC (ABCB1. ABCC1. ABCC2. Abcc4. Abcc5. ABCC6. ABCG2) et SLC (slc22A6. Slc22A8) matrices de PCR transporteur (numéro de catalogue CAPH-0468). Les valeurs d'expression relatifs ont été calculés comme 2 - Δ CT. où Δ C T est la différence dans le cycle de seuil (C T) des valeurs pour les gènes d'intérêt et le gène de ménage (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase). Si le C T est supérieur à 35, nous avons examiné le niveau d'expression trop faible pour être applicable. effets inhibiteurs directs de la drogue sur l'accumulation de calcéine. Des expériences pour déterminer les effets inhibiteurs directs des médicaments ont été effectués afin de mettre en évidence les mécanismes pharmacologiques qui conduisent à des concentrations de médicament intracellulaire. CMSP (5 x 10 5 cellules / ml) provenant de donneurs sains (n ​​= 6) ont été mises en incubation avec le MK571 inhibiteur de SCBA (30 uM) en tant que témoin positif ou avec différentes concentrations de FTC, FPV, ou EFV (0,5 à 10 pm, qui est la plage de concentrations solubles et non cytotoxiques, tel que déterminé précédemment [49]) pendant 30 min à 37 ° C dans 1 ml de milieu complet RPMI 1640. l'accumulation du médicament a été initiée par l'addition de calcéine-AM (0,1 uM par tube de 5 ml). Suivant 1 h d'incubation, les cellules ont été centrifugées (500 x g 5 min., 4 ° C), lavées deux fois dans une solution saline tamponnée au phosphate froid, puis fixées avec CellFix fixatif (01:10, 400 ul, 4 ° C) et analysées par cytométrie en flux. La fluorescence due à la calcéine a été contrôlée dans le canal 1 (FL1) et a été tracée sous forme d'histogramme de FL1 coloration. Le niveau d'accumulation de calcéine après incubation avec la calcéine-AM doit être augmentée par la présence du substrat ou un inhibiteur ABCC en raison de la concurrence ou l'inhibition de la calcéine-AM efflux. Statistiques. Les données sont exprimées en tant que moyennes ± écarts-types (SDS). GraphPad Prism (version 3.0) logiciel (GraphPad Software, San Diego, CA) a été utilisé pour effectuer des analyses statistiques pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes de données. La signification des différences entre les groupes et les témoins a été évaluée en utilisant une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) avec le post-test de Dunnett ou le test t de Student à deux queues. Les différences entre les moyennes ont été considérées comme significatives lorsque la valeur P était inférieure à 0,05. RÉSULTATS dosage de cytotoxicité. Aucun des composés testés (FTC FPV et EFV) exerce des effets cytotoxiques aux concentrations utilisées (0,5, 5 et 10 uM), évaluée avec un 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2, in vitro, le kit d'essai de toxicologie (Sigma Aldrich), 5-diphényltétrazolium à base de bromure. Dans l'accumulation intracellulaire in vitro de médicaments antirétroviraux dans les CMSP traités pendant 20 h in vitro. Les concentrations en médicament ont été mesurées suivant les 20 heures d'incubation avec 5 uM de chaque médicament. Par rapport à la concentration obtenue avec le FTC seul, la concentration de la FTC a augmenté de 42,4% ± 6,3% lorsqu'il est combiné avec FPV (P = 0,0002) et 61,1% ± 13,7% lorsqu'il est combiné avec FPV-EFV (P = 0,0007) ( Fig. 1A). Par rapport à la concentration obtenue avec FPV seul, la concentration FPV a augmenté de 30,0% ± 8,4% lorsqu'il est combiné avec le FTC (P = 0,004), 38,8% ± 9,4% lorsqu'il est combiné avec EFV (P = 0,003) et 56,1 ± 19,1% lorsqu'il est combiné avec FTC EFV (P = 0,014) (Fig. 1B). Par rapport à la concentration obtenue EFV seul, la concentration EFV n'a pas changé de manière statistiquement significative lorsqu'elle a été combinée avec FPV ou FTC FPV (Fig. 1C). Les concentrations intracellulaires (pmol / 10 6 cellules) de FTC (A), FPV (B), ou EFV (C), utilisés seuls ou en combinaison. Les données sont exprimées en moyennes ± écarts-types (n = 12). Les valeurs de P (*, P 0,001) ont été déterminées par ANOVA avec le test multiple de comparaison de Dunnett pour comparaison post hoc des résultats avec ceux pour le contrôle du véhicule. Effet de 20 h de traitement sur la fonction résistance au transporteur de multirésistance des lymphocytes. Afin d'expliquer les différences observées par quantification des médicaments utilisés seuls ou en combinaison, nous avons étudié la fonction de transporteur d'efflux suivant les traitements de cellules 20 h. Le pourcentage de l'activité SCBA et gp a été évaluée en mesurant les effets des inhibiteurs sélectifs de la Pgp et ABCCs (MK571 et ciclosporine, respectivement) sur le niveau d'accumulation de calcéine-AM. L'inhibition de 30 pour cent provoquée par uM MK571 ou 2 pM ciclosporine est résumée dans le tableau 1. activité relative de transporteur ABC mesurée par l'effet d'un inhibiteur sélectif (ciclosporine ou MK571) sur la calcéine-AM accumulation sur une Ciclosporine à une concentration de 2 pM n'a causé aucun changement statistiquement significatif du niveau d'accumulation de calcéine-AM dans l'une des cellules traitées. Pour tous les médicaments utilisés en combinaison ou seul, la diminution de la fonction ABCC étaient statistiquement significatives: les valeurs de P étaient 0,004 pour le traitement de la FTC, 0,001 pour le traitement TFV, 0,0048 pour le traitement EFV, 0,014 pour le traitement FTC-TFV, 0,002 pour le traitement TFV-EFV et 0,0001 pour le traitement FTC-TFV-EFV. Expression de ABC et AVOINE transporteur ARNm en réponse à la cellule de traitement avec des médicaments antirétroviraux. Après les 20 heures d'incubation avec un traitement antirétroviral, le niveau de transporteur expression de l'ARNm a été étudiée par semiquantitatif PCR en temps réel (Fig. 2). Nous avons évalué l'expression de MDR1. ABCC1. ABCC2. abcc4. abcc5. ABCC6. slc22A6. et slc22A8. qui codent Pgp, ABCC1, ABCC2, ABCC4, ABCC5, ABCC6, OAT1 et OAT3, respectivement. Tous ces transporteurs sont pensés pour être impliqué dans l'efflux antirétrovirale. Les valeurs C T pour le gène de ménage (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase) ne sont pas significativement modifiés par les traitements. Les niveaux d'expression de la P-gp (A), ABCC1 (B), ABCC5 (C), et ABCC6 (D) de l'ARNm dans les PBMC traitées avec le FTC, FPV, ou EFV, seul ou en combinaison. Les données sont exprimées sous forme de graphique à barres bas-haut; La ligne horizontale représente la moyenne (n = 3). Traité ou cellules non traitées avaient de très faibles niveaux de ABCC2. abcc4. slc22A6. et slc22A8 ARNm. Pour ces gènes, les valeurs C T étaient supérieurs à 35. EFV seule à une concentration de 5 uM avait tendance à induire ABCC1 et ABCC6. qui codent pour les transporteurs d'efflux xénobiotiques. Pour ABCC1. le niveau d'ARNm moyenne a augmenté de 2,0 ± 0,6 (cellules de contrôle) 4,6 ± 0,2 (cellules traitées avec EFV). Le ratio moyenne géométrique était de 2,6 (Fig. 2B). Pour ABCC6. le niveau d'ARNm moyenne a augmenté de 0,3 ± 0,1 (témoin) 3,2 ± 0,6 (cellules traitées avec EFV). Le ratio moyenne géométrique était de 1,7 (Fig. 2D). FTC seule à une concentration de 5 uM avait tendance à induire abcc5. qui code pour le nucléoside / nucléotide transporteur d'efflux ABCC5. Le niveau d'ARNm moyenne a augmenté de 3,3 ± 1,4 (cellules de contrôle) 16,2 ± 5,6 (cellules traitées avec le FTC) (P = 0,002). Le rapport entre la moyenne géométrique était de 5 (Fig. 2C). Pour tous les transporteurs étudiés (Pgp, ABCC1, ABCC5 et ABCC6), FPV a tendance à réduire le taux d'expression d'ARNm. Le niveau d'ARNm Pgp moyenne a diminué de 2,5 ± 1,2 (cellules de contrôle) à 0,5 ± 0,02 (cellules traitées avec TFV). Le niveau d'ARNm ABCC1 moyenne a diminué de 2,0 ± 0,6 (cellules de contrôle) à 0,45 ± 0,05 (cellules traitées avec TFV). Le niveau d'ARNm ABCC5 moyenne a diminué de 3,3 ± 1,5 (cellules de contrôle) à 0,1 ± 0,05 (cellules traitées avec TFV). Le niveau d'ARNm ABCC6 moyenne a diminué de 0,3 ± 0,1 (cellules de contrôle) à 0,1 ± 0,03 (cellules traitées avec TFV). Les rapports des moyennes géométriques étaient de 0,27, 0,25, 0,05, et 0,07 pour Pgp, ABCC1, ABCC5, et les niveaux d'ARNm ABCC6, respectivement. effet inhibiteur direct du médicament sur l'accumulation de calcéine. Les effets inhibiteurs directs de la drogue sur la calcéine-AM extrusion sont déterminées en mesurant la fluorescence de la calcéine avec ou sans MK571, en tant que témoin positif, ou des doses différentes de la FTC, FPV et EFV (fig. 3). Calcéine test évaluant l'augmentation dépendante de la concentration intracellulaire de la fluorescence (moyenne de fluorescence de la calcéine en unités arbitraires [au]) dans les lymphocytes traités par EFV, FPV et FTC. Le contrôle négatif () a été de 0,2% de DMSO, et le contrôle positif était de 30 uM MK571. Les données sont exprimées en moyenne ± DS (n = 6). Les valeurs de P (*, P ns, non significatifs) ont été déterminées par ANOVA avec le test multiple de comparaison de Dunnett pour comparaison post hoc des résultats avec ceux pour le contrôle du véhicule. Avec 30 uM MK571, le niveau d'accumulation de calcéine a été 63,86% plus élevé que pour le contrôle. EFV augmente le niveau intracellulaire de l'accumulation de calcéine d'une manière dépendante de la concentration. EFV semblait être le meilleur inhibiteur et a eu un effet à 10 uM similaire à celle de 30 uM MK571 (68,95% plus élevé que pour le contrôle). FPV a augmenté le taux intracellulaire d'accumulation de calcéine à 48,89%, avec 10 pM FPV (n = 6) d'une manière dépendante de la concentration. FTC augmente le niveau intracellulaire de l'accumulation de calcéine à 33,18%, avec 10 uM de FTC (n = 6) d'une manière dépendante de la concentration. DISCUSSION Les interactions médicamenteuses chez les patients recevant un traitement antirétroviral hautement actif sont souvent causés par plus d'un mécanisme, comme une mutation dans la transcriptase inverse du VIH ou la protéase; le métabolisme des médicaments, par exemple par phosphorylation; ou transporteur d'efflux modulation. Cela montre l'importance de connaître toutes les cibles potentielles en cause et compte tenu de leur interaction complexe pour l'individualisation de la dose (56). Très peu d'études ont examiné l'effet de la combinaison de la FTC, TFV et EFV sur leurs concentrations intracellulaires et ABC transporteur multidrogue modulation. le traitement des cellules pendant 20 h produit des augmentations significatives des niveaux FTC et TFV lorsque les combinaisons FTC-TFV, TFV-EFV et FTC-TFV-EFV ont été utilisés par rapport aux niveaux observés avec chaque médicament. En outre, les courbes dose-réponse ont été générées pour chaque médicament en présence de concentrations croissantes des autres médicaments. Nous avons montré l'augmentation des concentrations intracellulaires de TFV et la FTC avec des doses croissantes de EFV. La concentration de la FTC a augmenté avec une augmentation de la concentration de FPV et vice versa. Dans tous les cas, la concentration intracellulaire de nucléoside a atteint un plateau en commençant à une concentration de 1 pM ou 5 pM EFV les autres nucléosides (données non présentées). Ces résultats diffèrent de ceux de Borroto-Esoda et al. (8) en ce qui concerne la concentration TFV dans les CMSP lorsque TFV a été combinée avec la FTC. Une explication possible de cette contradiction pourrait être les différences dans l'expression du transporteur (5. 53) et les niveaux de métabolites phosphorylés entre CMSP stimulées par la phytohémagglutinine et l'interleukine-2 (8) et inactivés CMSP. Probablement en raison de la phosphorylation très lente dans notre système expérimental avec des PBMC inactivés intracellulaire FTC TFV triphosphorylés les concentrations de metabolites étaient à peu près la limite inférieure de quantification de notre méthode d'essai utilisée pour triphosphates NRTI (44). En ce qui concerne EFV, il n'y a eu aucun changement dans le niveau d'EFV quand il a été utilisé seul ou en combinaison avec d'autres médicaments testés. Cela peut être dû à la concentration intracellulaire / rapport de concentration extracellulaire, qui a été très élevé par rapport à ceux des autres médicaments testés (environ 44 fois plus élevée), éventuellement saturant transporteurs d'efflux. Alternativement, EFV est peut-être pas un Pgp ou substrat ABCC (13. 50). Afin d'expliquer les concentrations croissantes de la FTC et TFV dans les thérapies de combinaison, nous suggérons un transporteur interaction ABC. Nous avons étudié la Pgp et fonctionnalités ABCC après le traitement de 20 h avec des combinaisons de médicaments. Les activités ABCC et Pgp ont été mesurées (en pour cent) par la détermination des effets des inhibiteurs sélectifs de la Pgp et ABCCs (MK571 et cyclosporine, respectivement) sur l'accumulation de calcéine-AM. Calcéine-AM est un substrat d'index Pgp et ABCC bien établie (41. 55). Il est hautement soluble dans les lipides colorant fluorogène qui pénètre rapidement dans la membrane plasmique. A l'intérieur de la cellule, les estérases endogènes produisent la calcéine de colorant hydrophile et fluorescent, qui ne peuvent pas quitter la cellule par l'intermédiaire de la membrane plasmique (21). Considérant que calcéine-AM est un substrat de la Pgp et ABCC, calcéine est pas. Ciclosporine à une concentration de 2 uM est un inhibiteur spécifique de la P-gp (34), et 30 pM MK571 est un inhibiteur spécifique de la résistance aux médicaments SCBA associée (16). L'utilisation d'un test de fonctionnalité avec un substrat et deux inhibiteurs spécifiques, la présente étude fournit des preuves pour une diminution significative de la fonctionnalité ABCC, mais pas la fonctionnalité Pgp dans les lymphocytes traités avec FTC, TFV, et EFV, seul ou en combinaison, pendant 20 h ( Tableau 1 ). transporteurs ABCC pourraient jouer un rôle dans l'accumulation intracellulaire du médicament. Cependant, ils ne sont pas la seule cause. Par exemple, les traitements avec FTC, TFV et FTC-TFV ont eu le même effet sur la fonctionnalité ABCC, mais les concentrations de FTC et TFV étaient plus élevés lorsque la thérapie de combinaison a été utilisée. Depuis des analogues nucléosidiques / nucléotidiques sont hydrophiles, une hypothèse pourrait être que leur entrée dans les cellules par des transporteurs d'afflux plutôt que par diffusion passive. Ces transporteurs d'afflux, comme membres de la famille SLC, pourraient être modulées par des thérapies de combinaison de médicaments. Afin d'étudier l'effet du traitement antirétroviral sur la fonctionnalité ABCC, nous avons réalisé d'autres expériences sur l'expression de l'ARNm de transporteur et le transporteur efflux inhibition directe par les médicaments antirétroviraux. Dans notre système expérimental, MDR1. ABCC1. abcc5. et mARN ABCC6 étaient quantifiables, alors que ABCC2. abcc4. BCRP. OAT1. et ARNm OAT3 ne sont pas détectables. Les ARNm de la MDR1. ABCC1. et abcc5 ont été démontrées dans les CMSP (monocytes et lymphocytes) (1. 26. 32). Les niveaux d'expression des autres gènes étaient très faibles dans nos conditions expérimentales. Cependant, nos résultats ne peuvent pas exclure la possibilité d'une augmentation rapide du niveau de l'ARNm ou de la dégradation de l'ARNm après le traitement des cellules. La fonctionnalité réduite de ABCC n'a pas été liée à la diminution de l'expression de ABCC1. abcc5. ou ARNm ABCC6, sauf pour TFV. Une dissociation significative entre l'expression et l'activité a été décrite (1. 12. 39. 57). Étant donné que seulement trois répétitions des expériences ont été réalisées, aucun test statistique serait pertinent. Même si nous devons rester prudents en raison de la faible quantité de données obtenues pour les différents groupes de traitement, nous avons pu observer certaines tendances des augmentations ou des diminutions dans les niveaux d'expression de l'ARNm. L'analogue de nucléoside FTC tend à induire l'expression de l'ARNm abcc5, qui code pour le transporteur de nucleoside et nucleotide ABCC5 (22. 47. 58). EFV a eu tendance à induire ABCC1 et ABCC6 expression de l'ARNm; Ces deux gènes codent pour des transporteurs de xénobiotiques (4. 11). TFV a eu tendance à modifier les niveaux de MDR1. ABCC1. abcc5. et l'expression de l'ARNm ABCC6. Ces résultats suggèrent différents mécanismes de régulation entre les transporteurs. Les récepteurs nucléaires, tels que le récepteur constitutive androstane (CAR) et le récepteur pregnane X (RPX), jouent un rôle important dans la régulation de la transcription et de l'induction de plusieurs gènes comme MDR1 et ABCC2 (27. 51). En revanche, seules quelques études ont évalué ABCC1; En outre, les résultats ont été controversés (28. 37). Les promoteurs de gènes ABCC1 et ABCC6 contiennent un site Sp1 contraignant, qui est impliquée dans la régulation de leur transcription (25. 40). Le facteur liée à p45 du facteur nucléaire E2 (Nrf-2), un facteur de transcription pour l'élément d'anti-oxydant réactif, peut être requise à la fois constitutive et inductible de l'expression de l'ARNm ABCC1 (19). PXR est exprimé dans les CMSP (1); les facteurs de transcription Sp1 et Nrf-2 sont ubiquitaire exprimés dans des cellules de mammifères. EFV a été récemment démontré à agir comme un puissant ligand de la RCA et de PXR (14). Pas de données disponibles pour les autres médicaments. Les thérapies de combinaison n'a pas affecté l'expression de l'ARNm transporteur, probablement en raison de compensations de régulation entre les différents médicaments. L'utilisation de l'EFV seul a augmenté le niveau de ABCC1 ou ABCC6 expression de l'ARNm, mais l'utilisation de TFV seul diminué il; et l'utilisation des combinaisons (TFV-EFV ou FTC-TFV-EFV) a donné lieu à une compensation de l'effet observé avec EFV ou TFV seul. Le même effet a été observé avec la FTC. L'utilisation de la FTC seule a augmenté le niveau d'expression de l'ARNm abcc5, mais l'utilisation de TFV seul diminué il; et l'utilisation des combinaisons (FTC-TFV ou FTC-TFV-EFV) a donné lieu à une compensation de l'effet observé avec FTC ou TFV seul. Bien sûr, toutes ces observations méritent confirmation. Les effets des médicaments observés sur la fonction ABCC ne sont pas causées par ABCC expression de l'ARNm modulation. Par conséquent, nous proposons que les médicaments pourraient avoir un effet direct sur le transport ABCC. FTC, FPV et EFV à des concentrations allant de 0,5 um à 10 um ont augmenté les niveaux d'accumulation de calcéine-AM d'une manière dépendante de la concentration (Fig. 3), ce qui suggère l'interaction de ces composés avec des transporteurs SCBA, comme décrit précédemment (46 . 56). En conclusion, cette étude in vitro révèle un avantage de l'utilisation de la thérapie de combinaison, comme celle obtenue avec Atripla, en fonction des concentrations de médicament intracellulaire FTC et TFV. Cependant, il y a toujours un équilibre entre l'efficacité et les effets indésirables de toxicité /, et une bonne thérapie de combinaison peut nécessiter la surveillance des patients de médicament thérapeutique. Cet effet sur la concentration de la drogue semble être due en partie à une diminution de la fonctionnalité ABCC et en particulier à l'interaction directe des médicaments avec les membres de la famille ABCC. Nous fournissons également des preuves de différentes voies de transcription modulation d'expression entre les transporteurs d'efflux. REMERCIEMENTS Nous remercions le SIDA de l'Agence Nationale de Recherche pour le soutien financier.